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篇（1）

中圖分類號：Q55文獻標識碼：A文章編號：1672-979X(2009)01-0027-04

Preliminary Study on Bioactivity of Myxobacterium So ce shu-1 and Its Secondary Metabolites

LI Yan-li1, ZHANG Yin-lei2, LIU Ying, MA Zhong-liang2*

(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China; 2. Shanghai Key Laboratory of Bioenergy Crops, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Abstract：Objective To study the bioactivity of myxobacterium So ce shu-1 and its secondary metabolites which can be separately obtained. Methods The oven-drying method and DNS method were used to determine the cellulose-utilizing capability of So ce shu-1. The antibacterial and antitumor effects of the secondary metabolites of So ce shu-1 were investigated by filter paper method and MTT method, respectively. Results So ce shu-1 could use the cellulose from cornstalk and filter paper, and its cellulase activity was 12.30 UFPA/mL. The secondary metabolites of So ce shu-1 had broad-spectrum antimicrobial activity and could effectively inhibit the growth of tumor cells, especially inhibiting K562 cell line. Conclusion So ce shu-1 can be used in energy development and its secondary metabolites have a bright development perspective in drug and food fresh-keeping.

Key words：myxobacterium; secondary metabolite; bioactivity

目前已從黏細菌中發(fā)現(xiàn)約600多種生物活性物質(zhì)，約占微生物來源總數(shù)的5 %。黏細菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)種類繁多，結構新穎，作用層次多，作用機制多樣等。這些次級代謝物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫抑制、抗高血壓、抗糖尿病、抗瘧疾以及抗高膽固醇癥等特性。抗生素產(chǎn)生菌比例高于放線菌，現(xiàn)已成為生物活性物質(zhì)的新微生物來源[1,2]，如epo系列的抗腫瘤藥物，比傳統(tǒng)抗腫瘤藥物紫杉醇具有更多的優(yōu)點[3]。某些黏細菌能利用纖維素，為將纖維素（農(nóng)作物廢棄物的主要成分）轉(zhuǎn)化為生物燃料提供了新的選擇。因此，黏細菌在能源綜合利用及其次級代謝物在食品、醫(yī)藥工業(yè)的應用上都值得深入研究。我們現(xiàn)從這兩方面對分離到的黏細菌進行了初步研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和細胞黏細菌：So ce shu-1 按中國藥科大學生命科學學院報道的方法分離[4]。測試菌株：大腸桿菌（ Escherichia coli DH 5α）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、耐藥金葡菌[Staphyloccocus aureus atcc 29213(耐藥菌株)]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、短小桿菌（Corynbacterium parυm）、產(chǎn)氣桿菌（Aerobacter aerogenes）、百日咳桿菌（Bordetella pertussis）、傷寒桿菌（Salmonella typhi）、副乙傷寒桿菌（Salmonella paratyphi B）由本校微生物學教研室保存。腫瘤細胞株：HeLa、KB、K562以及SGC7901腫瘤細胞均購自上海生化細胞所。

1.1.2培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：KNO3 1.0；K2HPO4?2H2O 1.0；MgSO4?7H2O 1.0；CaCl2 1.0；FeCl3?6H2O 0.2，酵母提取物10 g；加入放線菌酮（0.1 %），pH 7.2。固體培養(yǎng)基：在發(fā)酵培養(yǎng)基中按10 g/L加入瓊脂。

1.2方法

1.2.1降解纖維素（1）將培養(yǎng)基分裝于試管，新華一號濾紙剪成約0.5 cm×5 cm 的長條，部分露于培養(yǎng)基液面外。接種So ce shu-1至培養(yǎng)基中，以不接種者為空白對照。

（2）從平板上接種菌種至3 mL液體選擇培養(yǎng)基上，37 ℃搖床培養(yǎng)1 d，成為種子菌液；取10 ％種子菌液轉(zhuǎn)入25 mL培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至菌液A600為0.3；再加入2 000 g玉米秸稈粉，配制成半固體狀，37 ℃培養(yǎng)1 d。培養(yǎng)后的混合物過濾取不溶物，烘干，稱重計算秸稈降解率［5］。

1.2.2黏細菌纖維素酶活性――濾紙酶活性（FPA）的測定[6]以新華濾紙為底物，加入1.0 mL適當稀釋的纖維素酶溶液，在特定pH值下，50 ℃反應1 h，用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定反應生成的還原糖[7]。1個濾紙酶活性單位（1 UFPA）定義為上述條件下每1 h由底物產(chǎn)生1.0 mg還原糖所需的酶量，用U/mL表示。

1.2.3次級代謝物的分離及抑菌測定分離次級代謝物的方法按文獻[4]，抑菌實驗用濾紙法[8]。向培養(yǎng)皿傾倒含菌培養(yǎng)基，鋪置濾紙片，在濾紙片上滴加一定量的次級代謝物提取液，培養(yǎng)并測量形成的抑菌圈。以吸取蒸餾水的濾紙片為空白對照。

1.2.4次級代謝物的細胞毒實驗用溴化四唑藍（MTT）法[9]。

2結果

2.1測定黏細菌So ce shu-1對纖維素的水解

2.1.1So ce shu-1對濾紙的利用培養(yǎng)2周后，So ce shu-1使濾紙變薄，纖維素分解反應呈陽性，表明So ce shu-1可利用纖維素作為碳源。

2.1.2So ce shu-1對秸稈的利用So ce shu-1與秸稈共培養(yǎng)后，經(jīng)烘干稱重，玉米秸稈干重減少0.310 g， 降解率為15.50 ％。

2.2纖維素酶活性的測定

培養(yǎng)液中纖維素酶的酶活性為 12.30 UFPA/mL。

2.3次級代謝物的抑菌作用

2.3.1抑菌譜的測定So ce shu-1次級代謝物抑制受試細菌的結果見表1。

由表1可見，黏細菌So ce shu-1次級代謝物對大部分受試細菌有明顯的抑制作用，即具有廣譜抗菌作用。

2.3.2抑制大腸桿菌的效果不同濃度的次級代謝物抑制大腸桿菌的結果見表2。

由表2可見，隨So ce shu-1次級代謝物量的增加，抑菌圈直徑增大，抑菌效果更加明顯，在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。

2.4次級代謝物對K562腫瘤細胞株的細胞毒作用

So ce shu-1次級代謝物對K562腫瘤細胞株作用24，48，72 h后，其對K562腫瘤細胞的抑制率見圖1。

由圖1可見，黏細菌So ce shu-1次級代謝物對K562腫瘤細胞株有很好的抑制作用。藥物濃度小于0.121 mg/mL時，抑制率隨藥物濃度增加而迅速增加，增幅明顯；藥物濃度大于0.121 mg/mL時，抑制率隨藥物濃度增加呈增加趨勢，但增幅趨于平緩；藥物作用時間越長，抑制效果越明顯，72 h的抑制效果明顯優(yōu)于48 h和24 h。腫瘤細胞24 h后的抑制效果見圖2。

由圖2可見，給藥24 h后，細胞形態(tài)發(fā)生很大變化，細胞萎縮呈球狀，黯淡無光澤，數(shù)量較稀疏，甚至出現(xiàn)細胞破裂溶出現(xiàn)象（A）；對照組細胞飽滿、有光澤（B）。

So ce shu-1次級代謝物作用于其他腫瘤細胞株以及與K562的比較見表3。

由表3可見，黏細菌的次級代謝物對多種腫瘤細胞均有抑制作用，抑制效果隨作用時間的延長而增強，與對K562的抑制效果類似。表明，黏細菌So ce shu-1次級代謝物對不同的腫瘤細胞株也有抑制作用，有明顯的時間依賴性。

3討論

能源問題是目前全世界面臨的重大課題，研究表明，黏細菌尤其是嗜纖維素的黏細菌能夠利用纖維素，這為木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為能源提供了一大類新的微生物來源。我們初步研究的結果表明，分離所得的黏細菌確能降解玉米秸稈。此菌株降解秸稈的機制有待進一步研究，菌株降解條件也有待優(yōu)化，以能更好的利用能源。

文獻報道黏細菌次級代謝物對大多真菌有一定的抑制作用，對細菌特別是革蘭陰性菌基本沒有抑制作用[10,11]，而本研究表明So ce shu-1次級代謝物對革蘭陽性菌和陰性菌均有很好的抑制效果。我們發(fā)現(xiàn)，So ce shu-1次級代謝物對大腸桿菌的抑制效果不僅明顯，而且可維持較長時間，出現(xiàn)抑菌圈6 d后仍未消失。尚無文獻報道黏細菌代謝物抑制大腸桿菌的效果[12,13]，提示該粗提物中可能存在新活性物質(zhì)，有潛在的開發(fā)利用前景。

黏細菌So ce shu-1次級代謝物對K562腫瘤細胞有較好抑制效果，我們還用其他腫瘤細胞如HeLa、KB和SGC7901做了實驗，結果表明次級代謝物對腫瘤細胞具有不同程度的抑制作用。此外，該菌的次級代謝物對MDA-MB-231和SMMC7721也有一定的抑制作用（數(shù)據(jù)未顯示），表明它具有廣譜抗腫瘤細胞活性；此菌的次級代謝物抑菌譜中，抑制菌多數(shù)為致病菌。從抑菌和抗腫瘤兩個方面的研究表明，此菌的次級代謝物在藥物和食品保鮮方面有很好的應用前景。

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篇（2）

[收稿日期] 2013-12-20

[基金項目] 國家自然科學基金項目（81130070，81072989）； 國家科技支撐計劃項目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）

[通信作者] 郭蘭萍，Tel：（010） 64011944，E-mail： glp01@126. com

[作者簡介] 黃蕾，E-mail：

歐洲花楸Sorbus aucuparia L.為薔薇科蘋果亞科花楸屬落葉喬木或小喬木，原產(chǎn)歐洲和亞洲西部溫帶高山區(qū)域[1]，其干燥成熟果實可食用和入藥[2]。我國花楸屬植物50余種，資源豐富，供藥用者約6種[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，蘋果亞科植物受到外界病原菌侵害時特異性地產(chǎn)生聯(lián)苯類化合物作為植保素[3]，Kokubun T等使用銅離子處理歐洲花楸葉片后，可以從葉片中分離出歐花楸素[4]，這種聯(lián)苯類化合物在健康的植株中并不存在，且其具有廣泛的生物活性。歐洲花楸是集藥用、食用、園林和生態(tài)價值于一身的珍貴樹種。

歐洲花楸懸浮細胞（SASC）生長速度快、周期短，可作為很好的研究材料[5]，已有研究發(fā)現(xiàn)用酵母提取物（YE）作為誘導子處理可使SASC迅速合成聯(lián)苯類化合物[6]。但是，目前這類具有植保素作用的化合物合成機制尚不明確，還有待進一步的研究。

本實驗以SASC為材料，通過檢測YE處理后SASC次生代謝產(chǎn)物的變化及其細胞培養(yǎng)液中pH、可溶性蛋白含量、細胞外Ca2+流等生理生化指標的變化，初步探究YE誘導SASC合成次生代謝產(chǎn)物的機制，尤其是從可溶性蛋白和鈣離子2個方面為機制研究提供了很好的思路和方向，為更深層次地研究打下基礎。

1 材料

歐洲花楸懸浮細胞系由中國科學院植物研究所葉和春研究員贈送。

培養(yǎng)箱（Conviron Adaptis CMP6010）；超大型搖床（ZYSA0351）；電子天平（Sartorius BS 2202S）；超凈工作臺（SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺）；分析型酸度計（JENWAY3510）；高效液相儀（Waters 2695_2996）；UV檢測器（T6新世紀19-1650-01-1169）；液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 6320 Ion Trap）；其他常規(guī)設備。

牛血清蛋白為美國MP公司產(chǎn)品；Yeast extract為OXOID公司產(chǎn)品；其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立 誘導出的歐洲花楸愈傷組織接種于含50 mL MS固體培養(yǎng)基的400 mL廣口瓶中，愈傷組織每 14 d 繼代1次，經(jīng)過3～5次繼代后，選擇疏松的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每 250 mL 三角瓶中分裝 50 mL 的液體培養(yǎng)基，置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。懸浮細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)速設定為 120 r?min-1。實驗中使用的歐洲花楸懸浮細胞是將減壓過濾后的 1.4 g細胞接種于含有 20 mL MS液體培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中。

2.2 YE誘導子的配制及處理 用蒸餾水溶解酵母提取物，配制60 g?L-1的母液，高壓滅菌。參照Liu B等處理方法[6]，處理終濃度為3 g?L-1。

2.3 歐洲花楸懸浮細胞中次生代謝產(chǎn)物的提取和檢測 將收獲的細胞用15 mL甲醇在研缽中研碎，使用濾紙和漏斗將濾液過濾到雞心瓶中，過濾后的細胞殘渣再用10 mL甲醇提取1次，合并濾液，將雞心瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。培養(yǎng)基用15 mL乙酸乙酯萃取2次，用分液漏斗分離，將乙酸乙酯層倒入提取細胞后的雞心瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。用1 mL的乙酸乙酯定容。

將提取液中的乙酸乙酯溶液揮干，用500 μL的色譜甲醇溶解，過0.22 μm的有機濾膜后用于HPLC檢測。

HPLC測定條件為：液相色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水-甲醇（50∶50）流速0.7 mL?min-1；紫外檢測波長為280 nm。

質(zhì)譜條件為：離子源為ESI；正離子模式；霧化氣壓力206.85 kPa；干燥氣為氮氣，干燥氣溫度300 ℃，流速10 L?min-1；毛細管電壓4 000 V；相對分子質(zhì)量掃描范圍100～600；柱尾分流 2∶1。

2.4 歐洲花楸懸浮細胞生物量測定 將培養(yǎng)的懸浮細胞真空抽濾至不滴水后，直接稱量細胞鮮重即為生物量，用鮮重（FW）表示，每個處理設置4個生物學重復。

2.5 細胞懸浮液pH測定 采用分析型酸度計直接測定培養(yǎng)基中的pH，每個處理設置4個生物學重復。

2.6 細胞中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 用考馬斯亮藍G-250法測定[7]，以牛血清蛋白作標準曲線，單位為mg?g-1（鮮重），每個處理設置4個生物學重復。

2.7 細胞外Ca2+流變化的測定 采用非損傷微測技術（NMT）[8]，用多聚賴氨酸玻片固定細胞，加入測試液穩(wěn)定15 min，在顯微鏡下找到直徑約200 μm的細胞簇，測定時間為10 min，每個處理設置5個生物學重復。

3 結果與分析

3.1 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞次生代謝產(chǎn)物的影響 細胞經(jīng)YE處理后，在其細胞提取物中檢測到5種聯(lián)苯類化合物，分別推斷為2′-OH-aucuparin（1），3，5-dihydroxy-biphenyl（2），noraucuparin（3），aucuparin（4），eriobofuran（5）。隨著誘導時間的延長，SASC合成的聯(lián)苯類化合物總量呈上升趨勢，但5種聯(lián)苯類化合物在細胞中的含量則分別呈現(xiàn)出不同的積累規(guī)律見圖1。

化合物1在YE誘導24 h后方可檢測到，在48 h時該化合物的含量達到峰值，隨著誘導時間的延長含量逐漸減少，但是在156 h時，其含量又呈現(xiàn)增加趨勢。

化合物2在YE誘導24 h時濃度達到峰值，在其他檢測時間點上該化合物的含量都較低。

化合物3是YE誘導后最先檢測到的化合物，其含量表現(xiàn)出周期性波動的趨勢，12～36 h其含量顯著增加，36 h時出現(xiàn)峰值，36～96 h含量又顯著下降，108～168 h含量再次緩慢增加。

化合物4含量相對其他化合物較高，在YE誘導24 h之后其含量逐漸增加，132 h含量達到最大值，132～168 h其含量呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。

YE處理后檢測到化合物5的時間最遲，直到36 h該化合物才積累到一定的濃度。隨著處理時間的延長，該化合物的含量呈波動性增加的趨勢，168 h時其含量達到最大值。

由以上結果可知YE誘導子對SASC合成聯(lián)苯類化合物的影響是一個動態(tài)的變化過程，隨著處理時間的變化，SASC合成不同的聯(lián)苯類化合物的組分及其組分間的配比都發(fā)生了改變。

3.2 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞生物量的影響 YE對SASC生物量的影響見圖2中的實際值，為了解YE誘導后細胞生物量與CK組的變化，根據(jù)已得到的SASC生長曲線的擬合函數(shù)：f（x） =0.369 9/[1+10.77 exp（-0.329 2x）][5]。

將取樣時間點代入函數(shù)，得到了細胞在正常生長條件下生物量的理論值（圖2中的理論值），用得到的理論值減去實驗中測得的實際值，得到了理論值和實際值之間的差值（圖2中的差值）。

在添加YE誘導子后（如圖實際值），細胞生物量呈現(xiàn)出緩慢的先增加又減少的過程，其變化幅度并不是很明顯。在取樣時間段內(nèi)，細胞生物量變化不大。

分析理論值、實際值之間的差值，說明在YE的影響下，SASC增長曲線偏離了細胞增長模型的曲線，YE對SASC的影響整體表現(xiàn)為抑制作用。隨著YE對SASC誘導時間的增加，YE對SASC的抑制作用也逐漸增大。

3.3 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞細胞懸浮液中pH的影響 隨著處理時間的增加，細胞懸浮液的pH也越來越小。細胞懸浮液的pH變化大致為2個階梯式下降，見圖3。48 h至108 h，pH緩慢下降，在108 h時降至6.445，至此第1階段結束；在120 h時細胞懸浮液pH降至6.045，在120 ～168 h，pH處于另一個下降階段，但下降的幅度較上個階段要大。

正常細胞培養(yǎng)狀態(tài)下，細胞懸浮液中的pH隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高[5]。添加YE后細胞懸浮液pH呈明顯下降趨勢，說明可能是SASC產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物導致pH變化，并且這種pH的改變并不利于細胞的生長。

3.4 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞中可溶性蛋白質(zhì)的影響 CK組細胞中的可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為緩慢下降的變化趨勢，見圖4。在24，48 h時含量最高，隨著時間的延長可溶性蛋白質(zhì)的含量開始下降，在120，144，168 h 3個時間點上，可溶性蛋白質(zhì)的含量相差無幾。YE組SASC中可溶性蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)出緩慢下降，再趨于穩(wěn)定的趨勢。24～96 h細胞中的可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸下降，96 h之后細胞中的可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸趨于穩(wěn)定。

將YE組細胞可溶性蛋白含量與CK組做差，得到YE處理后細胞中可溶性蛋白含量的增量，然后與CK組對比得到細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的相對增量，見圖5。從圖中可清晰得出，YE處理后細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量與CK組對比，主要經(jīng)歷2個階段，第1個階段其相對增量大概在50%左右，120 h之后進入第2個階段，細胞內(nèi)可溶性蛋白相對增量達到了140%左右。

3.5 酵母提取物對歐洲花楸懸浮細胞外Ca2+流的影響 YE對細胞外Ca2+流的影響，YE組與CK組細胞外Ca2+都表現(xiàn)為內(nèi)流現(xiàn)象，但是YE組Ca2+流平均值顯著小于CK組。從動態(tài)流速圖中也可以得出，雖然YE組與CK組都是在測定初期Ca2+內(nèi)流速度較大，隨著測定時間的延長速度逐漸減小，但YE組速度始終小于CK組。說明YE處理后導致細胞外Ca2+內(nèi)流大量減少，見圖6。

4 討論

YE處理后SASC提取物中檢測到5種聯(lián)苯類化合物，而正常培養(yǎng)條件下細胞并沒有合成這類化合物，說明細胞合成這類化合物來應對YE誘導子的脅迫。同時，隨著處理時間的延長細胞培養(yǎng)液中的pH逐漸降低，細胞生物量與CK組比增長明顯緩慢，說明SASC在YE脅迫下合成的次生代謝產(chǎn)物可能改變了培養(yǎng)液中的pH，導致了細胞的生長條件惡化、影響細胞膜的通透性，使細胞不能正常進行生長、分化、增殖等生命活動，最終導致細胞的生物量下降。

有研究推測聯(lián)苯類化合物合成過程中有一定的轉(zhuǎn)化順序[9] ，本研究發(fā)現(xiàn)5種聯(lián)苯類化合物含量隨著處理時間的延長呈現(xiàn)不同的積累規(guī)律，整體表現(xiàn)為：1，2，3號化合物處理后12 h即可用現(xiàn)有方法檢測到但相對含量較低，并且積累量迅速達到峰值然后下降，推斷這3種化合物可能是聯(lián)苯類化合物生物合成途徑上的上游化合物或中間體；4，5化合物積累時間相對較晚，且呈較小波動的穩(wěn)定積累狀態(tài)，其可能處于合成途徑的下游，結構相對穩(wěn)定。本研究在一定程度上明確了聯(lián)苯類化合物之間存在的轉(zhuǎn)化，為明確轉(zhuǎn)化順序提供了依據(jù)。

YE組細胞中可溶性蛋白質(zhì)的含量與CK組對比具有顯著性差異，在YE誘導下，可溶性蛋白質(zhì)的相對含量越來越大，最高時相對增量達到了147.76%，說明細胞為了抵抗真菌帶來的傷害，對防治機制的投入也越來越多，多合成的可溶性蛋白質(zhì)可能是初生生長所不需要的，用來調(diào)節(jié)催化次生代謝產(chǎn)物的合成。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)YE處理后SASC細胞外Ca2+內(nèi)流與CK組對比顯著減少，說明在細胞受到YE誘導子脅迫后，Ca2+作為信號分子可能介導細胞合成次生代謝產(chǎn)物的信號轉(zhuǎn)導。

本實驗通過分析生物量、細胞培養(yǎng)液中的pH以及細胞內(nèi)可溶性蛋白含量的變化，發(fā)現(xiàn)YE誘導SASC合成次生代謝產(chǎn)物的機制與道地藥材形成的逆境效應的假說[10]基本一致。在不受外界環(huán)境脅迫的情況下，植物首先滿足的是生長和繁殖；在面對不同因素的脅迫時，植物會合成次生代謝產(chǎn)物抵御外界不利環(huán)境，為此需要付出相應的成本，因而會降低植物的初生生長速度。此外，細胞應對YE脅迫迅速啟動了Ca2+信號分子，說明Ca2+可能介導SASC合成次生代謝產(chǎn)物的信號轉(zhuǎn)導。這些為YE誘導SASC合成次生代謝產(chǎn)物的機制研究拓展了思路，為下一步深層次的研究打下了堅實基礎。

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Mechanism exploration on synthesis of secondary metabolites in

Sorbus aucuparia cell cultures treated with yeast extract

HUANG Lei， XIAO Wen-juan， YANG Guang， MO Ge， LIN Shu-fang， WU Zhi-gang， GUO Lan-ping

（State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

篇（3）

[關鍵詞] 17-β雌二醇； 流體剪切力； 協(xié)同作用； 成骨細胞

[中圖分類號] Q 25 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.016 正常狀態(tài)下骨形成與骨吸收處于一種平衡狀態(tài)，該平衡是由成骨細胞介導的新骨形成和破骨細胞介導的骨吸收作用來實現(xiàn)的。MC3T3-E1細胞株是成骨分化研究中的經(jīng)典細胞株，很多學者將其用于骨形成機制的研究[1]。影響成骨及破骨細胞增殖及活性的因素有很多，雌激素和應力是影響成骨細胞活性及增殖的重要因素[2]。

研究[3-4]表明：雌激素對成骨細胞的功能有促進作用。還有學者[5]發(fā)現(xiàn)：流體剪切力（fluid shear stress，F(xiàn)SS）能夠活化成骨細胞的跨膜受體，促進成骨細胞增

殖。Yeh等[6]通過研究證實：雌激素可以通過雌激素受體增加成骨細胞對FSS的敏感性。本實驗采用MC3T3-E1成骨細胞系，對其施加不同濃度的17-β雌二醇及不同力值的FSS，探討17-β雌二醇、FSS以及二者共同作用對成骨細胞增殖活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

MC3T3-E1第3代細胞株（ADCC公司，美國）。17-β雌二醇、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT（Sigma公司，美國），胰蛋白酶（Gibco公司，美國），含105 U?L-1青霉素及100 mg?L-1鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京建成生物有限公司），Triton X-100（Fluka公司北京原生生物

技術有限公司分裝）。Multiskan MK3酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo公司，美國），平行板流室加力裝置（四川大學華西口腔醫(yī)學院FSS課題組提供）。

1.2 細胞培養(yǎng)及傳代

將第3代MC3T3-E1細胞系用α-MEM培養(yǎng)基（含體積分數(shù)為10%胎牛血清、105 U?L-1青霉素及100 mg?L-1鏈霉素）在37 ℃、5%CO2潮濕環(huán)境下培養(yǎng)，2～3 d換

液1次，待細胞均勻一層鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，用0.25%胰蛋白酶消化獲得細胞，用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 17-β雌二醇處理分組 將用于17-β雌二醇處理的細胞等分為A、B、C、D、E共5組，每組再分為4個小組，分別標記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4……以此類推。在A、B、C、D組的培養(yǎng)基中分別添加濃度為10-10、10-9、10-8、10-7 mol?L-1的17-β雌二醇，每一大組的4個小組分別培養(yǎng)1、3、5、7 d。E組為對照組，不加17-β雌二醇，其余處理同實驗組。設置30個重復樣本。

1.3.2 FSS處理分組 將用于FSS處理的細胞等分為a、b、c、d、e、f共6組，每組再分為3個小組，分別標記為a1、a2、a3、b1、b2、b3……以此類推。將各組細胞接種于放置在六孔板中的蓋玻片上，移入細胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至細胞完全貼壁。采用平行板流室加力裝置分批次對a、b、c、d、e組細胞分別施加每平方厘米力值為2×10-5、6×10-5、12×10-5、20×10-5、25×10-5 N的力，每組中3個小組的作用時間分別為15、60、120 min。f組為對照組，不施加FSS，其余處理同實驗組。設置30個重復樣本。

1.3.3 FSS+17-β雌二醇雙因素處理分組 經(jīng)上述實驗篩選出17-β雌二醇的最佳濃度和最佳培養(yǎng)天數(shù)后，設置雙因素作用組Ⅰ、FSS組Ⅱ、17-β雌二醇組Ⅲ、對照組Ⅳ。各組細胞的接種方法同1.3.2，其中Ⅰ、Ⅲ組添加最佳濃度的17-β雌二醇進行培養(yǎng)，Ⅱ、Ⅳ組添加等量DMSO培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)經(jīng)1.3.1步驟篩選出的最佳天數(shù)后，Ⅰ、Ⅱ組施加經(jīng)1.3.2步驟篩選出的最佳力值及時間。設置30個重復樣本。

1.3.4 MTT檢測 在規(guī)定時間內(nèi)，將實驗樣本用0.25%胰蛋白酶消化獲取懸浮細胞，將細胞分別置于EP管離心5 min，接種于96孔板中，添加適量培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)6 h至細胞完全貼壁后，每孔加入5 g?L-1的MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，然后置于酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測，波長為490 nm，記錄光密度A值。空白對照組做相同處理。

1.3.5 ALP活性檢測 獲取細胞及接種方法同上，根據(jù)ALP試劑盒的說明，分別加入試劑1、2液50 μL離心5 min后加入試劑3液50 μL，置于酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測，選擇520 nm波長，記錄吸光度A值。空白對照組做相同處理。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，同一時間組內(nèi)比較采用單因素方差分析，不同時間組間兩兩比較使用秩和檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 17-β雌二醇處理組

不同濃度17-β雌二醇作用不同時間后，經(jīng)MTT檢測得到的A值見表1。從表1可見：同一處理時間，C組（10-8 mol?L-1組）多優(yōu)于其他實驗組，實驗組多優(yōu)于E組（對照組）；各處理時間組的表現(xiàn)趨勢相同，均隨著17-β雌二醇濃度的增高，成骨細胞活性增強，達到高峰后逐漸回落。各時間組的增長百分比結果見圖1，可見各時間段的曲線趨勢大致相同，隨著17-β雌二醇濃度的升高，曲線升高，達到峰值后開始回落，其中5、7 d組中D組（10-7 mol?L-1組）呈現(xiàn)明顯負增長，5 d組中C組（10-8 mol?L-1組）明顯高于其他各組。

ALP結果的分析趨勢與MTT相同，表現(xiàn)為C3組成骨細胞分化活性最佳。

2.2 FSS處理組

2.2.1 細胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察可見：FSS作用前細胞呈多角形、梭形，排列無序（圖2左）；

FSS作用后細胞呈長梭形，細胞長軸沿力的方向排列（圖2右）。

2.2.2 MTT檢測結果 不同力值的FSS作用不同時間后，MTT檢測結果見表2：每個作用時間組內(nèi)，隨著力值增大，A值呈上升趨勢，到達高峰后，隨著力值繼續(xù)增大，A值則呈下降趨勢；在3組數(shù)據(jù)中，作用60 min組明顯高于其他組。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，1組（作用15 min組）內(nèi)各實驗組與對照組的差異無統(tǒng)計學意

義（P>0.05）；2組（作用60 min組）內(nèi)，c2組（12×10-5 N）優(yōu)于其他各組，e2組（25×10-5 N）低于對照組（P

2.2.3 ALP檢測結果 ALP檢測結果見表3。經(jīng)統(tǒng)計學分析，ALP的變化趨勢與MTT結果基本相同，c2組（12×10-5 N作用60 min）成骨細胞的增殖活性最佳。

2.3 FSS+17-β雌二醇雙因素處理組

將篩選出的最佳濃度（10-8 mol?L-1）17-β雌二醇和最佳FSS力值（12×10-5 N）用作雙因素處理，不同處理組的MTT和ALP檢測結果見表4。MTT數(shù)據(jù)分析結果顯示：Ⅰ組大于其他3組（P0.05），但均大于對照組（P

3 討論

隨著我國國民結構的老齡化，骨質(zhì)疏松患病率的增高、骨折危險性的增加及牙齒缺失后牙槽骨的吸收都成為現(xiàn)代醫(yī)學亟需解決的問題。如何維持骨改建的平衡，促進骨的生長和重建，抑制或減緩骨吸收成為近年研究的熱點。影響骨改建的因素很多，

雌激素和FSS刺激是其中2個重要的因素[2]，目前關

于這2種因素影響骨改建的研究也是一大熱點。

雌激素是由卵巢分泌的一種性激素，能夠維持機體的生理功能，可用來治療由于雌激素缺乏所導致的各種疾病。這種替代療法已得到普遍應用。雌二醇可以通過雌激素受體抑制成骨細胞凋亡，促進成骨細胞增殖，提高ALP活性，促使骨基質(zhì)礦化。有研究[7]發(fā)現(xiàn)：成骨細胞是雌二醇的直接靶器官。本實驗結果顯示：成骨細胞的活性并不始終與17-β雌二醇的濃度呈正相關關系，在17-β雌二醇濃度為10-8 mol?L-1作用5 d時，細胞的增殖活性最佳，而隨著濃度的繼續(xù)升高，增殖活性開始降低。

機械應力是影響骨改建的另一個重要因素，適當?shù)臋C械應力刺激能夠促進骨組織的生長。在骨改建過程中，成骨細胞的增殖和分化有重要的作用。吳丹等[8]研究證實：FSS作用于成骨細胞后，其增殖能力提高，細胞活性增強。本研究結果表明：對體外培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞施加FSS，力值為12×10-5 N作用60 min時，其促增殖效果最明顯；加力后可見細胞長軸沿力的方向排列。FSS施加力值和時間長短不同，成骨細胞的反應也不同。隨著力加載時間的延長，成骨細胞對應力的敏感性減弱，這可能與其逐步適應了應力刺激有關。當力值較大時，細胞活性反而降低，提示過大的應力非但不能促進成骨細胞的增殖反而會抑制其生長活性。在有關成骨細胞的體外研究中，應注意FSS強度的取值范圍。

Genetos等[9]研究證實：骨小管內(nèi)液體的流動對

成骨細胞的作用主要由剪應力介導。FSS加載裝置有很多種，平行板流室加載系統(tǒng)有其獨特的優(yōu)勢，在平行板流動小室里，能夠達到層流和二維流動，通過調(diào)節(jié)蠕動泵來提供穩(wěn)定有效的FSS，而且設備輕便，培養(yǎng)基更換方便，易于培養(yǎng)，易于鏡下觀察，加力所需培養(yǎng)基的量也較少。本實驗所采用的四川大學獲取專利的FSS加載裝置能夠精確地控制力值的大小[10]，較好地模擬了體內(nèi)骨組織的成骨細胞受到的應力狀態(tài)，其施加的FSS大小均一，并且可以調(diào)節(jié)到很小的范圍，得到的實驗結果具有代表性。

成骨細胞受到10-8 mol?L-1的17-β雌二醇和12×10-5 N的力影響時，細胞增殖活性明顯高于單純施加10-8 mol?L-1的17-β雌二醇和單純施加12×10-5 N的加力組，提示17-β雌二醇和FSS對成骨細胞具有協(xié)同作用。這可能與二者提高了成骨細胞對彼此的敏感性有關，亦有可能與二者共同促進某一離子通道的開放或者激活某一信號通路有關。

綜上所述，由本實驗可以得出以下結論：濃度為10-8 mol?L-1的17-β雌二醇作用5 d時，成骨細胞的增殖活性優(yōu)于其他17-β雌二醇處理組；FSS力值為12×10-5 N作用60 min時，成骨細胞的增殖活性大于其他FSS處理組；當二者同時作用于成骨細胞時，其增殖活性大于任一單因素處理組，此雙因素具有協(xié)同作用。本實驗為探討體外培養(yǎng)成骨細胞的骨代謝相關信號傳導通路提供了一定的參考。

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