核酶的化學本質匯總十篇

序論：好文章的創作是一個不斷探索和完善的過程，我們為您推薦十篇核酶的化學本質范例，希望它們能助您一臂之力，提升您的閱讀品質，帶來更深刻的閱讀感受。

篇（1）

反例教學法是指教師呈現少數精選的特例，引導學生進行批判的一種教學方法。因為反例教學法是從教學實際中來的，所以此種教學方法具有真實、生動的特點，能激發學生積極的情感，引起學生內心的共鳴，活躍學生的思維。反例教學法使用得當，一定能收到比正面切入更好的效果。

1. 光合作用一定需要葉綠體嗎？

舉個簡單的反例吧，藍藻是原核生物，并沒有葉綠體這種細胞器，但它依然能夠憑借體內的藻藍素進行光合作用，把太陽能轉化為有機物中穩定的化學能，所以光合作用必須要有光合色素，但并不一定需要葉綠體。

2. 生態系統中的生產者一定進行光合作用嗎？

反例是硝化細菌只能進行化能合成作用。生產者屬于自養生物，因此包括：

①進行光合作用的綠色植物；②進行化能合成作用的細菌，如硝化細菌、硫細菌等；③進行光合作用的細菌，例如光合細菌等。

光合作用和化能合成作用都是自養的方式。主要不同點是：直接能源不同，光合作用的直接能源是光能，而硝化作用的直接能源是化學能，硝化細菌將氨氣氧化，形成硝酸：

2NH3+3O22HNO2+2H2O 2HNO2+O22HNO3在這兩步反應中都釋放出化學能，將無機物合成有機物。

3. 動物在生態系統中的成分一定是消費者嗎？

不一定。動物絕大多數是消費者，有少部分是分解者，如屎克螂、蚯蚓，甚至大型動物如禿鷲等。

4. 進行有氧呼吸的生物一定有線粒體嗎？

不一定。好氧細菌，專性好氧菌，兼性厭氧菌等細菌只有核糖體而無其它細胞器，也能進行有氧呼吸，原因是含有跟有氧呼吸有關的酶，它們散布在細胞質基質內，有的也在細胞膜內膜上。效率是比擁有線粒體的細胞低的，而線粒體是真核生物主要提供能量的“動力車間”。

5. 單細胞的生物一定是原核生物嗎？

不一定。酵母菌是單細胞生物，但是真核生物。原生動物都是真核生物，但也是單細胞的生物。例如：草履蟲，變形蟲。

6. 酶的化學本質一定是蛋白質嗎？

不一定。酶的化學本質大多數是蛋白質，少部分是RNA。

化學本質是RNA的酶指核酶。核酶是具有催化功能的RNA分子，是生物催化劑。它的發現打破了酶是蛋白質的傳統觀念。核酶與蛋白質酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。

7. 真核細胞中的DNA一定分布在細胞核中嗎？

不一定。DNA主要在細胞核內，線粒體，葉綠體的基質也有。

8. 真核細胞中的RNA一定分布在細胞質中嗎？

不一定。RNA主要在細胞質內，還有少數在細胞核和核糖體內。

9. 所有的植物在生態系統中一定是生產者嗎？

不一定。 如： 菟絲子不能進行光合作用，只能營寄生生活，所以不屬于生產者。

10. 生態系統中所有的細菌一定是分解者嗎？

不一定。營腐生生活的細菌是分解者，而硝化細菌能進行化能合成作用，屬于自養生物。在生態系統中屬于生產者。

篇（2）

首先,大多數的蛋白酶在高溫下分子結構遭到破壞,并失去了活性,特別是大多數的蛋白酶,因為蛋白質的變性而失去活性,這種變性大多是不可逆的,而且隨著溫度的升高,這種變性更無恢復的可能,也就是說曲線的右側的某一位置上應該與橫坐標有一個交點,而課本上的插圖沒有。為此筆者完整地摘錄了《生化簡明教程》插圖如下:

從圖上可以明確看出右側也沒有交點。對于蛋白類的酶來說,高溫時失去活性是肯定的,是不是對于核酶來說有例外呢?筆者專門請教了南京師范大學的教授,得到的回答也是肯定的,RNA酶在高溫下也會失去活性,也就是說即使是核酶也應該有一個交點。

其次,在低溫下,酶的活性也會受到抑制,由于它的分子結構沒有被破壞,所以在適宜的條件下可以恢復,而在日常生活中也可以利用這一點來保存酶,而從《生物化學簡明教程》的上述插圖可以看出,左側是從原點開始的,也就是說有一個交點。蛋白質類的酶在低溫下一般不會發生變性,但活性極低,甚至可以低到難以檢測的程度,RNA酶在低溫下的活性也可能會很低,因此,給出這個交點倒是能夠讓人理解的。但酶在高溫下會發生變性,變性以后酶的活性大部分將會完全喪失,最適作用溫度高溫一側也必定存在一個交點,不給出這個交點無法讓人理解。

第三,酶的最適作用溫度不是一個固定不變的常數,其數值受到底物、種類、作用等因素的影響而改變,例如,酶的作用時間長短不同,所求的最適作用溫度亦不同,作用時間愈長,最適作用溫度愈低,作用時間愈短,最適作用溫度則愈高。其實只有在一定的條件下各種酶才有其一定的最適作用溫度,通常動物體內酶的最適作用溫度在37-50℃,植物體內的酶的最適作用溫度在50-60℃。

第四,和一般化學反應相同,酶的反應在一定的溫度范圍0-40℃內,其速度隨溫度的升高而升高,根據一般經驗每升高10℃的反應速度增加一倍,高溫下酶易失活,絕大多數酶在60℃即失去活性,故此,最適作用溫度的右側下降的幅度應該較大,左側上升的幅度應該相對較慢,曲線的兩側也應該不會程明顯的對稱。

綜上所述,酶在一定的條件下有一個最適溫度,并且在最適溫度兩側應該是不對稱,左側和橫坐標無限接近,右側和橫軸在某一位置有一個交點。所以酶受溫度的影響曲線應該大體上是這樣一個趨勢:

當然,蛋白酶和核酶在特性上有一定的差異,曲線也應該有所變動。

另外,從曲線上無法直接反映出來的是,蛋白質的變性作用如不過于劇烈,是一種可逆反應。這一點在教學過程中往往也無法作出解釋。例如,胃蛋白酶加熱至80-90℃時,失去溶解性,也無消化的能力,如將溫度再降低到點37℃則它又可恢復溶解性與消化蛋白的能力,但隨著變性時間的增加、條件的加劇,變性程度也加深,如蛋白質的結絮作用和凝固作用就是變性程度深刻化,這樣就達到不可逆的變性。這些也絕不是一個圖就可以說明的。當然上述是筆者的一孔之見,錯誤在所難免,請各位同仁不吝賜教。

參考文獻:

1.全日制普通高級中學教科書《生物》必修第一冊,人民教育出版社自然編著室編著

2.《生物化學簡明教程》高等教育出版社第三版由羅紀盛等編著

篇（3）

納米材料表面能量轉移（Nanomaterials surface energy transfer，NSET）在分析化學及生物藥物分析等領域被廣泛應用，如示蹤DNA或蛋白質分子的構象改變，識別DNA折疊的中間產物，監測DNA與金屬離子的相互作用以及測定與疾病相關的重要生物分子＼[1～4＼]。在本質上，NSET是偶極偶極相互作用，它與熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的不同之處在于NSET的能量受體是納米粒子表面，其通過在幾何學上各向同性的偶極向量分布接受供體的能量。NSET增大了供受體之間的能量轉移效率，相比FRET，它具有兩個重要特點＼[5，6＼]：同一個納米粒子能猝滅從可見到近紅外發射波長的熒光；能量轉移效率與距離的關系從1/R6變成1/R4，使得NSET的有效作用距離（約15 nm）比FRET（9 nm）增大了約2倍＼[6＼]。

鉛污染是一種分布廣泛的重金屬污染，它能導致人體腎臟損傷和智力發育遲滯＼[7＼]。因此，發展簡單靈敏的實時監測環境中Pb2+污染的方法意義重大。目前，基于脫氧核酶的鉛離子傳感器由于其高靈敏度和高選擇性被廣泛地用于測定水中Pb2+ ＼[8～14＼]。例如Lu等利用脫氧核酶建立了一系列比色法＼[10～12＼]和熒光共振能量轉移法＼[13＼]用于測定Pb2+。Pb2+脫氧核酶是由一個酶及底物鏈構成，當Pb2+存在時，脫氧核酶可以催化底物鏈發生特異性的水解斷裂。這一特性常被用來控制納米粒子聚集和熒光共振能量轉移供受體之間的距離。在這些方法中，靈敏度和選擇性都較好，但是由于所用脫氧核酶發生特異性水解斷裂的過程需要嚴格的反應條件，使得操作過程比較復雜。

研究發現，Pb2+由于具有與G四鏈體結構空腔尺寸適合的離子半徑（r =0.129 nm）以及與堿基的強配位作用，能與富含G堿基的寡聚核苷酸鏈形成穩定的G四鏈體結構＼[15＼]。近來有研究報道，凝血酶適配體（Thrombinbinding aptamer，TBA，5′GGT TGG TGT GGT TGG3′） 就可以選擇性地與Pb2+形成G四鏈體＼[16＼]。本研究中在TBA DNA的5′端修飾上熒光染料FAM作為能量供體，利用檸檬酸根穩定的球形金納米粒子作為能量受體，通過表面能量轉移建立了測定水溶液中Pb2+的分析方法。在Pb2+誘導下，該DNA鏈從自由纏繞狀態轉變成G四鏈體。由于單鏈DNA和G四鏈體的DNA（或雙鏈DNA）具有不同的靜電特性，對金納米粒子具有不同的吸附能力＼[17＼]。因此，與Pb2+濃度相關的DNA折疊過程會改變金納米粒子與染料分子之間的距離，從而影響兩者之間的能量轉移效率，具體體現在染料熒光強度的變化。本方法通過監測體系的熒光強度變化就可以簡單靈敏地實現對Pb2+的定量檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Hitachi F2500型熒光分光光度計（日本日立公司），以485 nm激發，500～600 nm 之間掃描熒光發射光譜。Shimadzu UV3600 型紫外可見近紅外分光光度計（日本島津公司）；PHS3C 型酸度計（成都世紀方舟科技開發公司）； QL901型漩渦混合器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）； 901型恒溫磁力攪拌器（上海精科實業有限公司）。

HAuCl4?4H2O（上海國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸三鈉（上?；瘜W試劑公司）；Pb（NO3）2（重慶川東化工試劑公司）；熒光素修飾的單鏈DNA（5′FAMGGT TGG TGT GGT TGG3′，上海生工生物工程技術與服務有限公司合成）。將DNA干粉以5000 r/min離心5 min后，加入1 mL新煮沸并冷卻的超純水混勻，4 ℃下保存待用。實驗用水均為超純水（重慶利迪現代水技術設備有限公司LD50GE型超純水機制備，18.2 MΩ cm）。實驗中使用三羥甲基氨基甲烷乙酸（TrisHAc）緩沖溶液控制溶液酸度。試劑均為分析純。

2.2實驗方法

2.2.1金納米粒子（AuNPs）的合成根據文獻＼[18＼] 的方法稍作修改合成了檸檬酸根穩定的AuNPs。具體步驟為：在100 mL 平底燒瓶中依次加入49 mL 超純水，1 mL 1% HAuCl4，磁力攪拌下加熱至沸騰；劇烈攪拌下迅速加入1 mL 5% 檸檬酸三鈉，溶液的顏色變為淺黃色；繼續磁力攪拌并使溶液保持沸騰，5 min內可觀察到溶液的顏色從淺黃色經由藍黑色，最終轉變為鮮紅色；停止加熱，繼續攪拌直至溶液冷卻至室溫。測得該溶液的LSPR峰最大吸收波長在520 nm處。其濃度依照LSPR消光光譜和朗伯

3結果與討論

3.1NSET傳感法檢測鉛離子的原理

因而與AuNPs之間具有強烈的親和力，使得TBA很容易被吸附到金納米粒子表面＼[17＼]。通過TBA在金納米粒子表面的吸附，修飾于TBA上的FAM染料分子可以靠近金納米粒子，發生從FAM到金納米粒子表面的能量轉移，使得FAM染料的熒光被猝滅。當加入Pb2+后，TBA由于含有9個G堿基，它們能與Pb2+特異性結合，使TBA從自由纏繞結構轉變為G四鏈體。由于G四鏈體中暴露在外的是帶負電荷的磷酸鹽骨架，它們與帶負電荷的金納米粒子之間能產生強烈的靜電排斥力＼[17＼]，顯著增加了TBA上攜帶的染料分子與金納米粒子之間的距離，減弱了染料分子與金納米粒子之間的表面能量轉移，體系的熒光信號得到恢復。在一定范圍內，形成四鏈體的程度與Pb2+加入濃度成正比，使得體系的熒光強度也與Pb2+濃度成正比，據此建立了基于表面能量轉移的分析方法用于定量測定水中的Pb2+的方法。

為了示蹤Pb2+引起的TBA構象改變以及與AuNPs之間的表面能量轉移，利用普通的熒光分光光度計分別測定Pb2+存在與否情況下修飾于TBA鏈上的FAM的熒光強度（圖2）。從圖2可見，在沒有AuNPs和Pb2+存在情況下，FAMTBA在520 nm處展示出很強的熒光發射（圖2a）；當加入AuNPs后，由于AuNPs與FAM之間有效的表面能量轉移，FAMTBA的熒光幾乎被完全猝滅（圖2c）。這一現象與文獻＼[21＼]所觀察到的金納米粒子對熒光團有較高猝滅效率是一致的。而當Pb2+和AuNPs均被加入體系中時，由于Pb2+誘導FAMTBA的構象發生改變，使得FAM與AuNPs的距離大大增加，降低了表面能量轉移的效率，從而使熒光得到一定程度的恢復（圖2b），據此實現對Pb2+的檢測。

3.2其它金屬離子的響應3.3線性范圍及實際應用

在最優實驗條件下，利用TBA探針基于表面能量轉移選擇性測定Pb2+。在Pb2+濃度為12.5～100 nmol/L范圍內，獲得了熒光恢復效率（F/F0）與Pb2+濃度間的線性關系，線性回歸方程為y=0.910+0.007c （y為體系的熒光恢復效率F/F0，c為Pb2+濃度（nmol/L）， R2=0.997，圖4），檢出限（3σ）為10 nmol/L。 依據美國環境保護署（EPA）規定的飲用水中Pb2+濃度不得高于0.015 mg/L （折合72 nmol/L）的標準＼[13＼]，本方法對Pb2+的線性響應范圍正好可用于監測飲用水中Pb2+的含量。采用標準樣品加入法，對自來水中Pb2+進行定量檢測。為避免次氯酸鹽的強氧化性對實驗的干擾，在分析之前，自來水需先煮沸。實驗結果見表1，標準加入回收率結果令人滿意。

4結論

通過Pb2+誘導FAMTBA形成G四鏈體，并基于FAM與AuNPs之間的表面能量轉移，建立了一種簡單、快速、靈敏的Pb2+傳感方法。在最佳實驗條件下，其檢測線性范圍為12.5～100 nmol/L，檢出限（3σ）為10 nmol/L。美國環境保護署（EPA）規定飲用水中Pb2+濃度不得高于0.015 mg/L （折合72 nmol/L），故本方法可用于監測自來水中的Pb2+。

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篇（4）

21世紀是生物科學高速發展的時代，生命科學新突破、新進展引發人們對生命現象的持續關注，生物工程技術的應用使人們的生活發生了很大的變化，同時給社會生產帶來了重大革新，這所有的變化都與生物化學學科的發展密切相關。生物化學是生物學各專業學生必修的一門專業基礎課程，學生對這門課程的掌握程度直接影響對其他課程的接受情況，生物化學被列為很多專業如生物類、農業類、醫學類等的考研或其他專業考試的科目，所以對該課程的掌握情況直接關系到學生的考研和就業。以全面培養學生的創新能力和綜合素質為目標，該課程在教學隊伍、教學內容、教學條件、教學方法與手段、教學網站建設、實驗教學、教學質量和水平、科研等方面都取得了長足進展，逐漸形成了自己的特色和優勢。2011年，生物化學被立項為臨沂大學校級精品課程，2012年被立項為山東省省級精品課程。讓學生在有限的時間內系統掌握生物化學知識和技能是教學的重要任務，然而在對2013級生物科學和生物技術專業學生的生物化學學習情況調查中發現，多數學生存在講授內容不能完全掌握、學習興趣不高等問題。在分析原因的過程中發現在理論和實驗教學中依舊存在一些問題。為了有效激發學生的學習興趣，培養其創新思維和實驗能力，擬進一步深化教學改革，全面提高教育教學質量，現分析如下。

一、目前本課程所面臨的問題

1.生物化學教材存在更新速度慢和部分重復的問題。目前生物化學課程所用教材門類繁多，但多數只重視生命的本質、生命的基本過程和基本規律，局限于以傳統的靜態生化、動態生化、機能生化為主的內容，而對生物化學的重大進展的重視不夠。生物化學課程的實用性很強，新概念、新成就、新技術層出不窮，這些都沒有體現在教材中，大大落后于學科的發展。生物化學還存在教學內容重復的問題，如糖、脂和維生素化學在無機化學和有機化學等課程中已經涉及其中大部分內容，而遺傳物質和蛋白質的生物合成及基因表達調控等與分子生物學、細胞生物學、基因工程等課程有部分重復。

2.生物化學實驗教學所占比例偏低，且驗證性實驗所占比例大。據統計，國外知名院校多單獨開設生物化學實驗課程，且實驗學時數與理論時數的比例在1.0以上，本校生物化學實驗學時較少，學時比為0.5左右。由于實驗學時少，且驗證性實驗所占比例大，如考馬斯亮藍法測定蛋白質含量、酵母RNA分離及組分鑒定等，而綜合性、開放性實驗所占比例小，學生普遍欠缺創新、設計能力，抑制了學生的主觀能動性，束縛其科學思維能力的發展，非常不利于實驗能力的培養。

3.實驗教學方法單一。生物化學實驗教學長期依附于理論教學而沒有受到應有的重視。教學方法以傳統講授形式為主，很少進行問題引導，課堂上以教師為主體，在學生動手實驗前，教師從實驗原理、方法、步驟、注意事項，甚至實驗過程中可能出現的問題都進行詳細講解，學生被動接受知識，照搬照做、步步模仿。教師在講授過程中多以單一板書的形式進行，多媒體網絡化教學手段沒有或很少應用，且沒有發揮出現代化教學手段的特色。

二、生物化學理論教學的優化———將生命科學最新進展與現有理論體系有機融合

為了解決生物化學教學內容陳舊、與其他學科存在內容重復的問題，許多學者提出了相應的解決方法。劉堰和肖訓焰提出教學內容要與時俱進，具體指出在緒論中增加生物化學研究工作的現狀與未來、在核酸化學中增加核酸的序列測定等內容。刪除蛋白質化學中蛋白質的分類，維生素和輔酶中維生素的概念。胡曉倩等提出，學生在掌握生物化學基本知識和技能的基礎上，要了解學科發展的前沿知識與高新技術。謝珍玉和郭偉良具體提出講授內容的重點部分，部分章節分配到其他學科中進行重點講解。生物化學教學內容的修改不是簡單的增刪或將部分章節分配到其他學科中講述，在增刪內容的同時需要解決該課程與其他課程內容的自然銜接問題，待添加的生命科學最新進展內容要與生物化學現有知識體系有機融合。如在講述基因調控的章節中向學生介紹該研究領域的新熱點———微RNA（microRNAs）。讓學生了解microRNAs是由非蛋白編碼基因轉錄物形成的莖環結構前體，由核酶剪切，成熟后形成長度為20～25nt的小RNA分子；真核生物、原核生物和病毒都可以編碼mi-croRNAs；與教學內容中出現的小分子干擾RNA進行對應比較；通過講述microRNAs的調控機制、功能、研究技術與方法、應用和前景使學生了解生命科學中該領域的最新發展趨勢。

三、生物化學實驗教學改革———圍繞國計民生的熱點問題設計實驗

加大生物化學實驗教學中綜合性、開放性實驗的比例，由培養學生基本實驗技能為“指揮棒”的教學模式逐漸轉變到培養學生創新性思維的模式中來。趙云濤等提出實驗項目分為基礎性、綜合性、設計型和創新型實驗。韓寒冰和劉杰鳳提出加強自主性實驗和研究性實驗教學、培養學生創新性能力的觀點。在培養創新應用型人才為目標的培養模式下，開展綜合性、開放性實驗的需求越來越迫切。開設這類實驗的目的是拉近理論和實際應用的距離，讓學生了解所學知識綜合起來可用來解決實際問題，從而激發其創新思維，培養其創新能力。在考慮到理論與實驗課程一致性和對應性的基礎上，圍繞國計民生的熱點問題設計綜合性、開放性實驗作為實驗教學改革的切入點，可用以解決教學中課堂與實驗室、理論與實踐相脫節的問題，并能實現各基礎實驗項目的有機結合。如2013年3月份報道臨沂部分地區冬小麥出現嚴重病害，表現為受害小麥葉片發黃、枯萎、矮化，嚴重地塊小麥完全枯死，導致這種病害的原因是小麥黃花葉病毒的侵染。據此設計小麥總RNA的提取及小麥黃花葉病毒檢測的實驗。提取小麥總RNA方法為實驗室常規TRIzol法，通過植物總RNA提取實驗使學生掌握核酸的基本組成、熟悉移液槍、離心機、研磨器的使用，讓學生理解RNA提取對實驗條件要求很高，原因是RNA酶無處不在，RNA易被RNA酶降解。隨后進行反轉錄及RT-PCR，以小麥黃花葉病毒的特異性引物進行擴增，獲得目的大小的特異性條帶。在實驗的過程中使學生掌握反轉錄、RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳等一系列生物化學基本操作。通過這類實踐性強的實驗將原有各自獨立的實驗統一到同一實驗材料和同一題目下，實現各基礎實驗項目的有機結合，體現出知識的系統性和實驗的研究性，同時同一題目下的各個小實驗一步緊連一步，增強學生的研究興趣。

四、生物化學實驗教學方法的改革———由單一到多元化的教學方法

近五年來，我校實驗中心引進一批具有博士學位的高學歷人才作為實驗員，這為生物化學實驗教學改革注入了新的活力。這些實驗員以直接或間接的方式參與生物化學實驗教學，可緩解緊張的教師資源，并且他們知識豐富、思路開闊、創造能力強、創新欲望高，能大大提高實驗教學質量。在實驗教學過程中，實驗員與本科生的年齡差別不大，興趣愛好相近，他們之間交流較容易和順暢，重要的是他們知道學生最想了解的是什么，能在相對輕松的環境中交流實驗心得，討論問題。對有獨特想法的學生，在實驗員及教師的指導下進一步深入研究，獲得更多的鍛煉。在進行實驗教學方法改革的過程中，孔繁華等提出實驗課“3+1”的教學方法；舒樂新等以啟發式、歸納式、問題式、討論式等教學法，讓學生成為教學的主體，激發他們的主動性和創造性。在進行實驗教學方法改革過程中以傳統教學方法與現代多媒體技術相結合的手段，直觀、生動地向學生展示實驗內容，充分調動其積極性。采用啟發式等的常規教學方法，要求學生在教師的啟發下獨立完成實驗準備、實施與總結，引導學生獨立思考、發現問題、解決問題，培養學生創新能力，形成開放式、互動式的教學模式。

五、結語

教學改革的目的是要增強學生素質的培養，加強對學生獲得知識、運用知識的能力。通過改革優化，調整理論課程內容，使學習內容具有基礎性、現實性和現代性。在理論與實驗教學內容對應的前提下，以社會中的熱點問題設計實驗，將理論學習中的各種基礎問題連貫起來，提高學生創新能力和實踐興趣。在精心調整生物化學教學內容的過程中，以新穎的實驗教學方法實現實驗教學效果的優化。生物化學內容復雜繁多，通過課程改革，學生在學習中得心應手，會促進其對其他課程的學習乃至對未來都會充滿信心，這將非常有利于學生的人生發展，而這樣的前景激勵著我們在生物化學課程改革的道路上不斷前進。

作者:王瑩 王浩 井文倩 郗冬梅 單位:臨沂大學生命科學學院 臨沂羅西小學 臨沂大學化學化工學院

參考文獻：

篇（5）

【關鍵詞】 乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR

血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判斷乙型肝炎病毒在體內是否復制，患者傳染性高低及選擇治療方案的重要指標。目前臨床一般采用實時熒光定量PCR技術對乙型肝炎病毒DNA拷貝數進行定量檢測。實時熒光定量PCR技術融匯了PCR技術的高效擴增，探針技術的高特異性，光譜技術的高敏感性等優點，通過直接檢測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的結果。但此技術可能與標本狀態密切相關，如溶血、脂血等。有研究表明Hb及其代謝產物可能與Taq酶相互作用，進而抑制Taq酶的活性，使PCR擴增效率明顯降低，導致定量測定結果偏低［1］。在臨床檢驗標本中，溶血標本較為常見，究竟溶血到何種程度會對乙型肝炎病毒DNA定量結果產生影響？本文將探討不同程度溶血對乙型肝炎病毒DNA定量檢測的影響。

對象與方法

1.對象 我們收集了ALT＞40 U/L、HBsAg陽性、HBeAg陽性、HBcAb陽性的乙型肝炎患者30例，其中男性17例，女性13例，年齡在18～53歲之間。

2.試劑 深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA檢測試劑盒（批號：20070501）、乙型肝炎病毒DNA陽性標準品。

3.儀器 BECKMAN全自動血球計數儀（型號：Coulter Ac.Tdiffe）、Lightcycle熒光PCR擴增儀(羅氏公司)、高速低溫離心機（Sigma公司）、干式恒溫器（杭州藍焰科技有限公司）、低溫冰箱（SANYO公司）。

4. 方法

（1）模擬溶血標本的制備：抽取30例乙型肝炎患者血液后，2小時內離心分離血清，這種不含Hb的血清作為無Hb對照組，然后取每位患者600 μl血清及適量紅細胞混合，置于-20℃冰箱保存備用。次日將含紅細胞的血清管取出放于室溫解凍，完全解凍后再將該管置于-20℃冷凍，如此反復凍融兩次，使得RBC完全破裂，釋放出Hb。在Coulter全自動血球計數儀測定每管紅細胞裂解后的Hb濃度，再用每位患者的血清稀釋，使得Hb終濃度為4 g/L、8 g/L、16 g/L、32 g/L，這些標本即為模擬溶血標本。

（2）乙型肝炎病毒DNA模板制備：取待測樣本及陰、陽性對照（試劑盒備有）各100 μl，分別加入到0.5 ml的離心管中，再分別加入100 μl DNA提取液1，震蕩混勻，13000 rpm離心10 min；吸棄上清液，再加入25 μl提取液2，震蕩至沉淀完全散開，100℃干浴10 min；冷至室溫后，13000 rpm離心10 min，保留上清液備用。

（3）PCR擴增：從試劑盒中取出乙型肝炎病毒DNA擴增反應液、Taq酶及UNG，室溫融化后按規定比例混合均勻，根據試劑盒說明書配置反應液，分裝于Roche毛細擴增管中，每次實驗均設2管陰性對照，1管強陽性對照，1管臨界陽性對照， 4管乙型肝炎病毒陽性工作標準品，其拷貝數分別為〗5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107拷貝/ml，將上述對照及樣本各加2 μl于加好反應液的Roche毛細管中，短暫離心后上機擴增。對檢測結果高于5.0×107拷貝/ml的標本進行稀釋后再擴增，使其結果落在試劑盒檢測線形范圍內。

（4）核酸擴增與熒光數據采集：擴增條件設置為37℃孵育3分鐘； 94℃變性1分鐘；再進入40個循環，每一個循環包括92℃變性5秒，60℃退火及延伸30秒，在60℃時單點收集熒光信號；儀器檢測通道選擇F1通道。

（5）分析條件設定：選擇F1通道，點擊Quantification進入定量分析窗口，設定Analysis方式為proportional，選定Noise bank項，閾值選定為剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點，且Ct值不出現任何數據為準。

（6）數據分析：四個陽性標準品Ct值均須小于38.0，標準曲線的擬合度須小于-0.980，陰陽對照品擴增須符合預期要求，得出的待測樣品的拷貝數才為可信結果。

5.統計學處理 將測得的乙型肝炎病毒DNA拷貝數轉換成常用對數，再利用SPSS軟件包進行統計，各含Hb的血清組與無Hb的血清組間差異采用配對t檢驗進行差異性檢驗。

結果

Hb為4、8、16、及32 g/L的血清組中乙型肝炎病毒DNA拷貝數與無Hb的血清組分別進行配對t檢驗，P值均大于0.05，因此每一組含Hb的乙型肝炎病毒DNA拷貝數與不含Hb的血清組均無顯著性差異。見表1。

表1 各組乙型肝炎病毒DNA拷貝數及統計量（略）

討論

實時熒光定量PCR技術檢測乙肝病毒DNA已在臨床廣泛使用，但在臨床應用中，影響的因素也較多，如實驗室條件，操作人員的技術，臨床標本的狀態等。一些研究認為溶血標本對FQPCR技術檢測乙肝病毒DNA有影響，但也有研究認為這種影響并不顯著［2］。本文通過模擬不同程度溶血標本，認為溶血達到32 g/L對檢測結果無顯著影響（P＞0.05）。陳英劍等認為溶血至20 g/L時對檢測結果無影響，這與本文研究結論基本一致［3］。

本文將乙型肝炎患者抽血后2小時內分離的血清作無Hb對照組，然后通過反復凍融使標本溶血，再用乙型肝炎患者自身血清稀釋以獲得不同Hb濃度溶血標本，在模擬不同程度溶血標本過程中，不添加任何外來物質，使檢測結果受外在因素影響程度減少到最低。實驗結果經統計處理后，發現溶血程度控制Hb的濃度在32 g/L以下時，對乙型肝炎病毒DNA的檢測結果無顯著影響（P＞0.05）。出現此結果的原因可能有兩個方面，一是在HBVDNA模板的提取過程中，標本中的Hb經100℃煮沸10分鐘后已經變性沉淀，再經離心后，待測樣本上清液中可能不會有Hb的存在，僅剩Hb的衍生物［4］。而且隨著提取方法的不斷改進，提取液中對DNA聚合酶的干擾物質不斷減少，去除Hb越來越徹底。另一方面FQPCR對乙肝病毒DNA定量檢測只是一種半定量方法，并不是對擴增后終產量進行完全定量，它是根據樣本可檢測的起始擴增時間與標準品擴增曲線得出的半定量結果。本文收集的30例病人的血清中HBVDNA含量均大于107 拷貝/ml，樣本中HBVDNA含量較高，血清中HBVDNA含量小于107 拷貝/ml時，檢測結果是否有差異，尚需進一步研究。且本文只對溶血程度小于32 g/L時進行探討，溶血大于32 g/L時對檢測結果的影響，也需進一步驗證再作結論。溶血程度達到32 g/L時已是肉眼非常清晰可見，臨床溶血樣本的溶血程度大多在32 g/L以下，因此我們認為一般的溶血樣本可以接受。但需注意的是，本文只是對深圳匹基公司試劑進行探討，不同廠家，可能因使用不同的提取液及提取方法而出現不同的結論，有文獻報道，使用PEG沉淀煮沸法和直接加熱煮沸法提取HBVDNA所得的定量結果有差異，因此不同提取方法對檢測結果有一定的影響［5］。一般而言廠家提供試劑時會給出較為清晰的影響試劑盒使用的各種因素，有能力的PCR實驗室在試劑使用前，可進行此類評價實驗，制訂合適本實驗室使用標本留取標準。隨著衛生事業的發展，人們對檢驗質量的的要求越來越高，但檢驗質量不可避免的受較多因素影響，標本質量是重要的影響因素之一，如溶血、脂血、餐前、餐后等，對各項影響因素進行量化研究，如溶血、脂血達到何程度時則定為不合格樣本，都應該有明確的指標。本文只對溶血程度小于32 g/L時進行探討，溶血大于32 g/L時及血清中HBVDNA含量小于107 拷貝/ml拷貝時對檢測結果的影響，需進一步驗證再作結論。

參考文獻

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［2］李金明，王露楠. 樣本處理對聚核酶鏈反應測定乙肝病毒核酸的的影響［J］.中華檢驗醫學雜志，2000，23（6）：337-339.

篇（6）

藥品專利保護問題一直是我國醫藥產業發展的薄弱環節。由于法規體系的不健全以及專利保護意識淡薄，使得許多原本我國擁有自主知識產權的成果都因此落得“為他人做嫁衣裳”的命運。這些教訓告訴我們：要實現制藥大國向制藥強國的轉變，我們首先必須努力實現向藥品知識產權強國的轉變。因此，作為行政主體的政府和市場主體的企業都必須增強專利保護意識，而其中―個重要方面，就是要加強對專利保護制度的研究，尤其是國外先進制度的研究，以取長補短。美國臨時專利申請規定是美國對其專利保護制度進行創新的典型，對它進行研究具有一定的積極意義。

1　美國的臨時專利申請規定

1．1 什么是臨時專利申請規定 臨時專利申請(provisionalpatentapplication，PPA)規定是美國專利商標局于1995年6月9日在美國國內率先提出實施的，是美國在烏拉圭回合談判之后，根據談判協議修改其專利法的產物。臨時專利申請規定主要涉及美國專利法的兩個條款，即第111條(b)款和第119條(e)款[1]。美國專利法第111條(b)款指出了與臨時專利申請相關的一些條件，即建立申請日需要提供說明書和附圖；維持申請日需要在規定的時間期限內提交申請費和發明人姓名。第119條(e)款指出臨時專利申請(下文簡稱“臨時專利”)為申請人確立了一個優先權，其保護期限是1年，在此期限和保護范圍內，只有該“臨時專利”的持有人可以提出有關專利申請。但是，專利申請案以臨時申請的方式提出后，必須在1年內正式向美國專利商標局提交轉換請求書，將“臨時專利”轉為正規申請，否則此“臨時專利”在1年后自動失效。正規申請的內容應包含臨時專利申請的內容和經改寫后的內容。

臨時專利申請規定所針對的對象主要是：已經脫離基礎理論階段，具有應用前景和潛在商業價值，但還不能申請專利的成果。如果一項成果的應用前景還不明朗，可以先申請臨時專利，待進一步研究后再申請正式專利。對于藥品而言，它可以有效地保護剛剛發現而尚未完全證明有效的藥物分子或藥靶[2]。

1．2　“臨時專利”的實質相當于“國內優先權”

筆者認為，臨時專利不是真正意義上的專利，臨時專利不能予以審查，也無法授予專利權。實質上，它僅僅是為申請人在將申請轉換為正規申請之前保留一個優先權日，相當于國內優先權，而這種較低成本的申請方式使得美國申請人與外國申請人享有烏拉圭回合談判的同等權利。

2　美國“臨時專利申請”規定與中國的“本國優先權”規定的比較

臨時專利申請制度的本質相當于國內優先權。我國1992年修改后的《專利法》中第二十九條第二款對“本國優先權”作出了規定：申請人于1992年1月1日以后在中國第一次提出發明或者實用新型專利申請(包括藥品和用化學方法獲得的物質的專利申請以及食品、飲料和調味品的專利申請)之日起12個月內，又向專利局就相同主題提出專利申請的，可以享有優先權。此后，我國于2002年修訂的《專利法實施細則》的第三十三條又對獲得本國優先權的條件作出了具體規定：沒有要求過外國優先權或者本國優先權，即說明本國優先權應是首次使用而且只能適用一次；還未被專利局授予專利；不屬于按照規定提出的分案申請的。

由此可見，這兩種規定的相同之處，除了上述獲得本國優先權的條件外，對有效期的規定都是12個月，如果12個月內沒有提出第二次申請，則“臨時申請”或“在先申請”自動失效；此外，本國優先權的客體都被嚴格限制為發明和實用新型。

2．1　“臨時專利”與“國內優先權”的積極意義

2．1．1　避免申請人在未獲得專利權的同時遭遇技術秘密公開

根據美國專利法的規定，約有10％的專利申請可以作為特例在專利授權前不予公開，其他的在18個月之后公開；我國專利法規定，所有的專利申請自申請日起第18個月應予以公布。因此，通常情況下，如果專利申請人由于客觀條件的限制而對其發明創造的“三性”缺乏正確的估價，那么很有可能因不能通過實質審查而無法獲得專利授權，但其技術秘密卻已經公開了。然而，如果申請人運用國內優先權制度，預先進行專利申請而取得申請日，然后，如果申請人能在12個月內通過進一步研究完善技術，達到專利授予的要求，則申請人可以要求優先權，以避免在此期間別人的公開影響到自己發明創造的專利性；如果申請人在12個月內沒有達到這些要求，還可以撤回在先申請，避免對其技術的公開。

2．1．2　有利于保護申請人的利益，鼓勵創新

何時提出專利申請最有利一直是人們關注的問題。過早申請專利，可能會由于一些技術問題尚未完全解決，難以通過專利的實質審查；過晚申請專利又擔心他人占了先機。本國優先權規定較好地解決了這一矛盾。申請人可以在成果還不是完全成熟時先提出申請，達到盡早保護自己的發明構思與基本發明技術的目的，避免第三人在此期間搶注專利。在保留了一個較早的申請日之后，發明者有1年的時間來完善技術成果，在此期間還可以籌集實施該發明所需要的資金，必要時甚至還可以將成果市場化，以獲取經濟效益。

2．1．3　有利于促進發明人加快研究進程

由于本國優先權的期限是1年，這就在客觀上要求發明人必須在第一次申請之后的1年內完成對相同主題的發明創造的完善工作。如果專利申請人既沒有在1年之內完成相應工作，也沒有采取更改專利保護方法的措施，那么就很可能因為高估了發明創造的價值，或者因他人在此期間對該項技術的公開行為而導致其無法獲得專利權。正是在這種制度的激勵下，發明者在第一次提出專利申請后，趕在本國優先權期限屆滿前完成技術完善的工作，從而間接加速發明創造的進程，推動科技的發展。

2．1．4　有利于減輕申請人的負擔

中美兩國專利法都規定專利的修改只能限定在原說明書記載的范圍內，在申請之后所作的改進與完善，通常只能作為新的申請提出。但一項發明創造往往會形成兩項前后關聯的專利，即后一專利是前一專利的改進專利，而專利權人則要長期就同一發明創造支付兩件專利費用。本國優先權允許申請人在1年的期限內將相同主題的發明創造進行完善，只發生一件專利費用，而且還允許將若干個臨時專利合并為一件正規專利申請，這在減輕專利權人的經濟負擔的同時，也調動了其進行創新的積極性。

2．1．5　有利于提高專利申請的質量，加強專利保護

一般來說，首次申請專利時，就技術本身而言，發明者對成果的認識及其解決技術問題的方案等都有一定的局限性，背景技術資料也收集得不夠全面；另一方面，為了趕時間，在

申請文件的撰寫和保護范圍及權利要求的確定上，可能會考慮不周。而通過要求國內優先權，申請人與人能夠有較充足的時間對技術與專利保護的系列問題，甚至對市場上可能出現的相關問題，進行較深入的研究分析。在此基礎上對第一次專利申請作出的修改、補充和完善，無論是從技術上還是從權利要求的層面來看，其專利的可靠性與穩定性，相對來講都要好―些，一旦遇到侵權訴訟，勝訴的把握會更大一些。這對于加強專利的保護都是有利的。

2．2　美國臨時專利申請的積極意義

2．2．1　申請方式更簡易、快速

臨時專利申請可以先提出一個簡化的申請，這樣使申請人以較低的初始投資，贏得1年時間去評估發明的商業潛力。因此它規定，臨時專利申請不需撰寫完整的詳細說明書，不必辦理完整的申請文件，遞交申請時也只需滿足最低的形式要求。美國專利商標局不對臨時專利申請的價值進行評估，審批也比較簡單，而且其申請費用也比正式專利申請少得多。臨時專利申請只需要支付150美元，而正規申請申請費就是500美元，還不包括律師費、各種文書制作費用及權利要求等費用。我國《專利法實施細則》第三十二條規定，申請人要求優先權手續的，應當在書面聲明中寫明第一次提出專利申請(以下稱在先申請)的申請日、申請號和受理該申請的國家；要求本國優先權的，申請人提交的在先申請文件副本應當由國務院專利行政部門制作。相對而言，我國的在先申請雖然較之于后一次申請的手續也相對簡單，費用也相對低廉，但比起美國臨時專利申請的規定來還是復雜了一些。

2．2．2　專利期限更長

美國專利法第154條(a)款中規定，依第119條內容規定的臨時專利申請的優先權不計人專利權期限，也就是說1年的未決時間不包括在20年的專利保護期限內，該期限從正規專利申請遞交之日起算。因此，臨時申請給申請人提供了12個月的專利保護寬限期，其專利保護期限實際是21年。而我國《專利法實施細則》規定，專利法所稱申請日，有優先權的，指優先權日。我國對專利的20年保護期是從專利申請日開始計算的，也即從優先權日算起，因此，專利保護期限是20年。

3　美國臨時專利申請對我們的啟示

3．1　我國制藥企業應積極利用本國優先權制度，強化專利保護意識

上文已經提到國內優先權制度能充分保護申請人的利益，因此企業應該充分利用這一武器，盡早地為自己的研究成果申請專利保護，防止苦心研究的成果被別人搶占先機，“為他人做嫁衣裳”。

此外，我國的本國優先權制度也有較美國的臨時專利申請制度更為靈活的地方，我國《專利法實施細則》第三十三條第二款中規定，申請人要求本國優先權，在先申請是發明專利申請的，可以就相同主題提出發明或者實用新型專利申請；在先申請是實用新型專利申請的，可以就相同主題提出實用新型或者發明專利申請。發明專利和實用新型各有利弊，申請人可以利用本國優先權更加靈活地選擇對自己更有利的保護方法[3]。當申請人對其發明創造所具專利性程度把握不準確時，就可以利用此項規定將其發明創造先申請實用新型專利，待技術成熟后再申請發明專利；如果申請人先提交了發明專利申請，卻發現該技術可能達不到發明專利的水平或者該產品的市場壽命不長，也可以在12個月內再遞交實用新型專利申請，而申請日依然是第一次申請的時間。

3．2　我國制藥企業應關注國外的專利制度

我國《專利法》第二十條規定，中國申請人要把在國內完成的發明創造向外國申請專利的，必須首先或同時向中國專利局申請專利，使得發明創造可以首先在我國得到利用。而美國專利法第111(b)(7)款規定申請人不能利用外國申請為他的臨時申請建立優先權。否則外國申請人享受的是2年的寬限期，而首次提交臨時專利申請的美國發明人則只有1年，有違國民待遇原則。因此，目前我國申請人申請外國專利只能通過巴黎公約或PCT途徑。但我們完全可以通過關注美國的臨時專利獲取專利信息，把握專利動態，間接受益。

3．2．1　關注“臨時專利”，避免侵權糾紛

企業在進行新藥研發時，應對藥品或化合物的專利狀況有所了解，避免侵權糾紛的發生。我國《藥品注冊管理辦法》第十一條也規定，藥品注冊的申請人應當對其申請注冊的藥物或者使用的處方、工藝、用途等，提供申請人或者他人在中國的專利及其權屬狀態的說明；他人在中國存在專利的，申請人應當提交對他人的專利不構成侵權的聲明。由于申請“臨時專利”的諸多優點，國外越來越多的企業或研發機構在“臨時專利”申請的比例也越來越高。因此關注專利狀況不能不關注“臨時專利”，一旦發現本企業正在研發的某藥物或化合物已經在國外申請了“臨時專利”，企業在決策時就應慎重考慮進退問題，以免造成不必要的浪費。

3．2．2　關注“臨時專利”，獲取信息，促進仿創結合

從我國科研機構和制藥企業的研發實力來看，目前要脫離仿制，實現完全自主創新是有一定困難的，但在仿制過程中產生創新技術，即“仿創結合”則是目前國家提倡的道路。實踐證明，只有在仿制道路上勇于創新的企業才能在市場競爭中立于不敗之地。企業通過技術創新實現經濟效益突飛猛進的例子屢見不鮮。例如天津藥業在1992年引進地塞米松工藝的基礎上，通過1993年和1997年的先后兩次重大技術突破，使地塞米松系列產品的成本先后降低了30％和40％，迫使跨國公司于1998年完全退出了壟斷10年的中國市場。該企業的產品已占國內市場的80％，亞洲市場的45％[4]。我國企業可以通過關注國外的臨時專利，獲取最新的科研信息，

3．3．3　關注“臨時專利”，及時把握專利動態

臨時專利于正規專利之前提出，更具時效性。關注臨時專利，可以及時把握專利動態，根據情況變化作出反應，以免陷入被動。例如2003年4月，當非典的陰云剛剛散去的時候，美國疾病控制與預防中心就申請了一項涉及非典的臨時專利。這無疑對我國是一個巨大的沖擊，針對這一情況，中科院上海生命科學研究院立即啟動了防治非典新方法和新藥物的研究工作，上海市知識產權局即布置專利檢索人員收集國內外與非典相關的病因病源、抑制治療、藥物研究等方面的專利文獻，不到10天時間就從“中外專利數據庫”中篩選了有關抗冠狀病毒、病毒抑制、核酸、核酶等方面的上萬篇專利文獻，其中最新的數據是2003年4月23日才公開的專利文獻，有效地促進了我國在非典領域的研究成果居于世界領先水平。

總之，我國的專利制度要與國際接軌，必然要研究世界各國的專利制度，尤其是國外有所創新的制度，這對我國專利制度的完善有積極的借鑒意義。本文所述的美國臨時專利申請規定，也希望能對我國的制藥企業有所啟示。

參考文獻

1　程毓渡。如何把握知識產權與專利授權[N]．醫藥經濟報，2005，9，37．